葡聚糖標准曲線斜率是多少

1. 我想做β-葡聚糖的FITC熒游標記，從百度知道知道你很久前做過的，麻煩介紹交流下。

目的：測定腫瘤組織異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FITC�dextran)粘附水平是否可作為腫瘤血管密度的量化指標。方法：用endolgin疫苗免疫小鼠後，在同一隻小鼠上同時建立小鼠Meth A纖維肉瘤模型和藻酸鹽包被腫瘤細胞試驗模型，2周後將FITC�dextran注射入小鼠體內，然後手術完整摘取腫瘤組織和藻酸鹽顆粒，取部分腫瘤組織進行免疫組化檢測血管密度的同時，將其他組織和藻酸鹽顆粒勻槳並離心，取上清檢測熒光強度，分析二者之間是否存在直線相關關系。結果：免疫組化和肉眼觀察顯示2種測定方法均有明顯的血管生成效應，用FITC�dextran粘附測定腫瘤組織血管相對密度和藻酸鹽包被試驗均能較好地量化測定抗血管生成效果，直線相關分析表示二者的疫苗免疫實驗組FITC�dextran的測定值之間呈明顯的正性相關關系（r = 0.962，P＜0.01）。結論：和藻酸鹽包被試驗相比，FITC�dextran測定腫瘤組織血管相對密度是一種簡單有效的量化測定腫瘤組織血管生成水平的方法。

【關鍵詞】 腫瘤；血管；動物模型；藻酸鹽包被腫瘤細胞試驗

Quantitative determination of relative tumor vascularity by FITC�dextran adsorption

TAN Guang�hong， HUANG Feng�ying， WANG Hua， et al.

( Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Medicine, Haian Medical College， Hainan， Haikou 571101, P.R. of China)

〔ABSTRACT〕 Objective: To evaluate whether determination of FITC-dextran adsorption in tumor tissues is suitable for quantitative evaluation of tumor angiogenesis. Methods: After inction of antiangiogenic immunity in mice using xenogenic endogin protein, Meth A fibrosarcoma tumor cells were incubated in the conventional method of setting tumor model. Alginate�encapsulate tumor cell assay was performed on the same mouse at the same time, and no immune mice were used as control as well. 14 days later, alginate beads and the whole tumor tissue were removed surgically and quantified the uptake of FITC�dextran, and partial tumor tissues were used for immunohistochemistry determination of the vessel density, using antibody reactive to CD31. In addition, linear correlation analysis was used to evaluate the relationship. Results: The antiangiogenic effects were significantly inced in the two models respectively, and linear correlation analysis of the uptake of FITC�dextran showed significant positive correlations between the two vaccine�immunized treated groups in the two models (r=0.962, P＜0.01). Conclusion: Determination of relative tumor vascularity in the tumor tissue using FITC�dextran adsorption can be used as an antiangiogenic model in vivo.

〔KEY WORDS〕 Tumor; Blood vessel, Animal model， Alginate�encapsulate tumor cell assay

腫瘤的發生、發展和轉移與血管生成（angiogenesis）密切相關。我們在研究實驗中發現〔1，2〕，如果抗腫瘤血管生成的治療方案確實有效，除了表現為腫瘤體積較小，生存時間延長外，在腫瘤的組織切片中也表現為血管密度明顯減少。藻酸鹽包被腫瘤細胞模型是目前定量測定腫瘤血管生成的標准方法〔3〕，它的主要原理是將異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖（FITC�dextran）注射進入體內後，葡聚糖就會粘附於內皮細胞表面、部分可能被內皮細胞吸收而滯留於血管腔中。通過測定藻酸鹽顆粒中的葡聚糖的熒光強度並和標准曲線相比較，就可得到量化的結果。因此我們設想，如果腫瘤組織中血管密度相對較少，腫瘤組織的血管粘附、吸收和滯留葡聚糖的數量也應該相應減少，通過比較不同腫瘤組織吸收FITC�dextran相對熒光強度，就能夠量化了解不同腫瘤組織的血管密度。本研究將FITC�dextran注射於活體荷瘤小鼠中，然後測定腫瘤組織FITC�dextran水平並和藻酸鹽包被模型相比較，了解二者之間是否存在相關關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

FITC�dextran購自Sigma Chemical公司，藻酸鈉(Alginic Acid，Sodium Salt)購自Sigma Chemical 公司，苯巴比妥鈉購自上海新亞葯業有限公司，RPMI�1640培養基和胎牛血清(FCS)購自美國GibicoBRL公司。重組豬endoglin蛋白為作者構建表達並純化〔1〕。6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自四川大學動物中心，小鼠Meth A 纖維肉癌（Meth A）細胞株由生物治療國家重點實驗室（四川大學）贈送。大鼠抗小鼠CD31(PECAM�1)單克隆抗體購自BD Pharmingen公司，VECTASTAIN Elite ABC Kit 購自Vector Laboratories公司。熒光酶標儀Microplate Fluorescence Reader，FL600，為Bio�Tek公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫方法 將重組endoglin蛋白凍乾粉劑於無菌條件下稱量，溶於無菌的生理鹽水(NS)中，與滅菌的氫氧化鋁凝膠佐劑〔A〕(OH)3按4∶1(V/V)混勻（氫氧化鋁終濃度約為2 mg/mL），室溫下放置30～60 min。然後將實驗小鼠隨機分兩組，每組各10隻。實驗組小鼠每隻背部皮下注射上述混合好的endgolin蛋白疫苗每次10 μg(100 μL)。對照組每隻小鼠注射NS:佐劑為4∶1的混合液100 μL。每組注射均為1周1次，共4次。

1.2.2 細胞培養 從液氮中取出凍存保種的Meth A細胞，迅速置於37 ℃水浴復溫融化，在超凈工作台內用培養基洗滌1次。然後用完全培養基於37 ℃，5% CO2培養箱中培養。收集對數生長期細胞，1 500 rpm離心3 min，細胞沉澱用無抗生素無血清的培養基洗滌1次，計數細胞數量後用無抗生素無血清的培養基調整細胞濃度至1×107/mL。

1.2.3 藻酸鹽包被模型的建立 按文獻進行〔3〕，略加改進。無菌條件下，首先將藻酸鈉溶於無菌生理鹽水，終濃度為1.5% (W/V)；並將收集培養的腫瘤細胞重懸於1.5%藻酸鈉溶液中，然後用1 mL加樣槍將細胞和藻酸鹽混合液緩慢滴入磁力攪拌的250 mM CaCl2溶液中，形成乳白色的小珠。實驗前進行預實驗，使每個小珠約含有2×105個細胞。繼續靜置於250 mM CaCl2中30 min即可使用。此後將第4次免疫7 d後的小鼠用苯巴比妥鈉0.1 mL (100 mg/kg)腹腔注射麻醉。小鼠麻醉後置於解剖台上，切開背部皮膚，在切口左側下方上下不同部位各植入1粒按上述方法制備好的藻酸鹽小珠，縫合皮膚。14 d以後，從尾靜脈注入100 μL(100 mg/kg) FITC�dextran，30 min後斷頸處死，取出藻酸鹽小珠，常溫下加入0.5 mL的生理鹽水，混勻標本，放置1 h， 1 500 rpm離心5 min。取上清液200 μL用熒光酶標儀測定熒光強度，用不同濃度的FITC�dextran制備標准曲線，得出每隻小鼠的測定值。

1.2.4 小鼠腫瘤模型的建立 上述藻酸鹽小珠植入小鼠體內後，同時將Meth A細胞接種到每隻小鼠的右側脅肋部皮下，每隻接種2×106個細胞(0.2 mL)。14 d後斷頸處死，在取出藻酸鹽小珠的同時，用手術器械分離出完整的腫瘤組織，准確稱重後剪碎腫瘤組織，按重量每克腫瘤組織加入生理鹽水2 mL，磨碎成勻漿，在搖床上搖動1 h後1 500 rpm離心5 min，同樣取上清200 μL測定熒光強度，對照相應標准曲線得出各個標本的測定值。

1.2.5 腫瘤組織血管免疫組化染色 參考文獻〔1，2〕取各組新鮮腫瘤組織進行冰凍切片。抗CD31免疫組化方法按Vector Laboratories公司試劑盒操作說明書進行。腫瘤組織微血管定量也按相關文獻報道方法進行〔1，2〕。

1.3 統計學分析

模型內腫瘤體積和熒光強度比較用Student's T檢驗，模型間相關性用線性相關分析。

2 結果

2.1 腫瘤生長和免疫組化檢測腫瘤血管密度

用重組豬的endoglin蛋白作為抗腫瘤血管生成疫苗具有明顯的抑制腫瘤生長和抗血管生成的作用，疫苗免疫組腫瘤生長明顯慢於非免疫對照組；疫苗免疫組和非免疫對照組腫瘤重量分別為(0.52±0.13) g和(2.37±0.31) g（P＜0.001），（圖1 A）。14 d後處死小鼠，用抗CD31免疫組化染色腫瘤組織血管，和非免疫對照組相比（圖1C），結果發現，疫苗免疫組腫瘤組織血管明顯減少（圖1D），疫苗免疫組和非免疫對照組腫瘤組織血管密度平均每高倍視野分別為(10.82±3.91)和(46.58±8.73)（P＜ 0.001）（圖 1 B）。

註：A：腫瘤重量；B：微血管密度定量分析；C：疫苗免疫治療組腫瘤組織免疫組化；D：非免疫對照組腫瘤組織免疫組化；Trea：疫苗免疫治療組；Cont：非免疫對照組。

圖1 Endoglin重組蛋白抑制腫瘤血管生成（略）

2.2 FITC�dextran粘附測定腫瘤組織血管生成狀況

腫瘤細胞接種14 d後處死小鼠，經尾靜脈注射FITC�dextran，取出腫瘤組織後測定相對的FITC�dextran粘附數量，疫苗免疫組和非免疫對照組FITC�dextran 的粘附量分別為(2.53±0.82) μg和(7.56±1.27) μg，統計分析表明兩組間具有顯著性差異（P＜0.001）（圖2 A）。

2.3 藻酸鹽包被實驗測定腫瘤組織血管生成效應

當14 d後切開植入藻酸鹽顆粒部位的皮膚後，肉眼就可看見疫苗免疫組（圖 2 C）的藻酸鹽顆粒表面幾乎沒有可見的血管，而非免疫對照組的藻酸鹽顆粒（圖 2 D）均見有明顯的血管分布，疫苗免疫組FITC�dextran 的粘附量也明顯低於非免疫對照組，分別為(0.76±0.35) μg和(2.34±0.79) μg，統計分析表明兩組間同樣具有顯著性差異（P＜0.001）（圖2 B ）。

2.4 腫瘤組織FITC�dextran粘附與藻酸鹽包被實驗測定相關性分析

將腫瘤組織與藻酸鹽包被實驗測定疫苗免疫實驗組的FITC�dextran粘附量數值進行相關性分析，將這兩組數值代入直線相關公式求出相關系數r值，並進行假設檢驗，結果相關系數r=0.962，假設檢驗P＜0.001，表明二者之間呈明顯的直線正相關（圖3）。

註：A：腫瘤組織直接測定的FITC�dextran量；B：藻酸鹽包被腫瘤細胞試驗測定的FITC�dextran量；C：疫苗免疫治療組藻酸鹽小珠；D：非免疫對照組藻酸鹽小珠；Trea：疫苗免疫治療組；Cont：非免疫對照組。

圖2 腫瘤組織直接測定FITC�dextran和藻酸鹽包被腫瘤細胞試驗（略）

圖3 腫瘤組織直接測定和藻酸鹽包被腫瘤細胞試驗測定的FITC�dextran呈直線正相關（略）

3 討論

Endoglin是一種細胞膜表面分子，主要表達於激活的內皮細胞表面；研究證實endoglin是腫瘤血管生成的一個新的標志〔4〕，用抗endoglin抗體在動物腫瘤模型中已取得了良好的抗血管和抑制腫瘤生長的效果〔5，6〕。本研究所應用的豬endoglin是我們從豬胚肝中克隆得到cDNA的基礎上，將其構建於原核表達載體，然後誘導表達並經嚴格純化得到的重組蛋白質。在以往的研究中，我們已經證實用這種重組蛋白作為小鼠endoglin的異種同源蛋白疫苗，免疫小鼠能誘導小鼠產生抗豬和鼠自身endoglin的抗體，並且在多個腫瘤模型中發現具有抗腫瘤血管生成從而明顯抑制腫瘤生長的作用〔1，2〕。本研究用免疫組化和藻酸鹽包被腫瘤細胞實驗都發現用豬的endoglin 重組蛋白作為疫苗免疫小鼠後，確實具有抗小鼠Meth A纖維肉瘤血管生成的作用。

抗腫瘤血管生成研究是當今腫瘤研究中的一個熱點，幾乎每天都有新的研究成果發表於不同的學術刊物上，因此，一種簡便有效而又能夠定量的抗血管生成模型對腫瘤抗血管生成研究具有十分現實的意義。當前，研究中常用的抗腫瘤血管生成模型主要包括：角膜模型、雞胚內囊膜模型和藻酸鹽包被腫瘤細胞模型等，前者需要在小鼠的角膜上進行微創手術，一般實驗者很難掌握，實驗結果難以量化處理。而雞胚內囊膜模型的操作也比較復雜，許多葯物還不適合用於此模型，同樣也難以進行量化處理。藻酸鹽包被模型盡管能准確量化，並且能從外觀上看出抗血管生成效果，但是需要進行麻醉和手術，在這個過程中實驗小鼠很容易死亡。另外，藻酸鹽濃度控製得不好或是操作過程中出錯都可導致包被於藻酸鹽中的腫瘤細胞死亡，影響實驗結果。在本研究中，我們直接用接種2周的腫瘤組織為研究對象，因為任何有效的抗腫瘤血管生成的治療都會抑制腫瘤血管生成，致使腫瘤生長減慢，除了表現為腫瘤體積減少和重量較輕以外，整個腫瘤組織血管密度和血管腔容積也應該相應減少。因此，當從外周把FITC�dextran灌注進機體後，在相同重量的腫瘤組織中，血管密度和血管容積均減少的腫瘤組織粘附、吸收和滯留FITC�dextran的量也應該相對減少，這樣通過測定相同重量的不同腫瘤組織就可以量化比較出這些差異，本研究的實驗結果完全支持這些觀點。經相關分析，實驗結果和現在文獻常用的藻酸鹽包被腫瘤細胞實驗結果呈顯著的直線正性相關關系。但是，由於直接測定腫瘤組織血管相對密度的操作方法就是常規的建立腫瘤模型的方法，具有過程簡單，易於操作等優點。盡管目前文獻尚未見有實際應用的報道，但是我們認為這一種直接測定腫瘤組織粘附FITC�dextrane進而量化腫瘤血管相對密度的方法實用可行，具有推廣應用的價值。

【參考文獻】
1 Tan GH, Wei YQ, Tian L, et al. Active immunotherapy of tumors with a recombinant xenogeneic endoglin as a model antigen 〔J〕. Eur J Immunol, 2004,34(7):2012�2021.

2 Tan GH, Tian L, Wei YQ, et al. Combination of low�dose cisplatin and recombinant xenogeneic endoglin as a vaccine inces synergistic antitumor activities〔J〕. Int J Cancer,2004,112(4):701�706.

3 Hoffmann J, Schirner M, Menrad A, et al. A highly sensitive model for quantification of in vivo tumor angiogenesis inced by alginate�encapsulated tumor cells 〔J〕. Cancer Res,1997,57(17):3847�3851.

4 Fonsatti E, Vecchio LD, Altomonte M, et al. Endoglin: an accessory component of the TGF�β�binding receptor�complex with diagnostic, prognostic, and bioimmunotherapeutic potential in human malignancies 〔J〕. J Cell Physiol,2001,188(1):1�7.

5 Seon BK, Matsuno F, Haruta Y, et al. Long�lasting complete inhibition of human solid tumors in SCID mice by targeting endothelial cells of tumor vasculature with antihuman endoglin immunotoxin 〔J〕. Clin Cancer Res,1997，3(7): 1031�1044.

6 Matsuno F, Haruta Y, Kondo M, et al. Inction of lasting complete regression of preformed distinct solid tumors by targeting the tumor vasculature using two new anti�endoglin monoclonal antibodies 〔J〕. Clin Cancer Res,1999,5(2):371�382.

2. 乳糜微粒的注意事項

(1) 免疫透射比濁法：① 關於抗血清：比濁測定與其他方法相比對抗血清的要求更高。比濁法以用多克隆抗體為宜。抗血清中必須不含雜抗體。必須十分重視從人血清中提取的apoA-Ⅰ達到免疫純、色譜純與電泳純，這不是一般實驗室都能做到的。抗血清效價(滴度)不可低於16。目前國內某些商品試劑中，apoA-Ⅰ抗血清效價極低，選購試劑盒時必須注意。如果沒有在選購前鑒定抗血清質量的經驗，應請有條件的單位鑒定之。② 上法中標本(血清)稀釋200倍是為了便於手工操作(加樣100μl)，如有精密加樣器，可作20倍稀釋(用10μl)。為了適合不同實驗室的條件(如不同類型的自動化儀器)，作適當修改時應注意抗原抗體的比例，必須十分注意反應體系中不可有抗原過量，線性上限不可低於2.5g/L。換言之，抗血清用量必須充裕，否則標本中apoA-Ⅰ高水平時測出結果偏低。目前國內某些商品試劑盒不但抗血清效價過低，操作中所定標本用量又過大(如3-5μl)，抗體明顯不足，測出結果必然不準確。③ 為了達到准確測定的目的，apoA-Ⅰ與B比濁測定(終點法)中必須作校準曲線計算結果。一定范圍(低標本用量)濃度(X)與濁度(Y)基本上成直線關系，直線回歸計算出在Y軸上有一定截距(A值<0.1)，所以用單點校準計算結果偏差較大，使測出結果不能准確反映濃度的高低(高的偏低，低的偏高)。千萬不要因為單點法簡便而忽略了測定的准確性。無論用何種自動化儀器，必須先試作校準曲線。如果在所用儀器及特定條件下反復測試，回歸線的截距不明顯時，才能採用單點校準法。標本用量在3-5μl時，即使加大抗血清用量，濃度與濁度也不成直線關系，只能用曲線直線化轉換後計算。④ 主要干擾因素是血清本身的混濁(如高脂血清)，用超離心或脂肪酶水解等標本預處理方法都不實用。用表面活性劑消濁的作用也有限，所以在測定中必須作標本空白管。除了自動分析中可採用兩點法外，手工法用單一試劑而不扣除標本空白的做法是錯誤的。為了減少基質效應對濁度反應的影響，必須用定值血清作校準物。此外，塵埃粒子、比濁皿劃痕等干擾也必須排除。⑤ 有的商品試劑盒(包括某些進口產品)所附校準血清定值不準確，是誤差的重要來源。(2) 火箭電泳法：① 抗原稀釋倍數與抗血清用量的選擇，應以火箭峰清晰、校準曲線斜率適中並成直線為宜。本法同時測定apoA-Ⅰ與apoB，應調整兩種抗血清用量，使二者峰高有區別，apoB峰高不小於1cm。② 不同種類來源的抗血清(如兔與羊)，在等效價的情況下進行試驗，結果會有差異。apoA-Ⅰ測定以兔抗血清為好。用兔血清時峰形尖細，而羊血清所產生的峰粗，峰尖圓鈍，有時在峰頂前出現虛影。校準血清所作校準曲線斜率也不同。但不論用何種抗血清，定量結果差別不大。③ 在一定條件下電泳，不同稀釋度校準血清的峰高不會有明顯變動，校準曲線斜率基本一致。如標本峰高超出校準曲線范圍時，應調整標本稀釋倍數後重測。板間CV通常小於5%。④ 火箭電泳結果可以用染色法或直接肉眼觀察可見的火箭峰。前者用標本少，節省抗血清，但如適當增加標本及抗血清用量，不染色更為方便。所用瓊脂糖應為標准電滲或低電滲的，凝膠中加入適量葡聚糖或聚乙二醇可使火箭峰更清晰。⑤ 火箭峰的測量可以計算面積或峰高，面積是峰高乘以峰寬(峰半高處的寬度)。測量精度最好能達0.1mm。須用機械或電子放大設備。標准曲線范圍內峰高以1-4cm為宜。⑥ 本法適用於少量標本分析。也適用於apoAⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E及Lp(a)測定。

3. β-葡聚糖的測定方法

β-葡聚糖含量的測定方法，大致可歸納為如下幾類：
（1）粘度法：其原理是大麥抽提液的粘度主要由β-葡聚糖產生(Burnett，1966；White等，1983)。這種方法可靠性較差，因為不同來源的β-葡聚糖的分子量不同；而在葡聚糖含量相同時，分子量較大者產生的粘度較大，這樣β-葡聚糖粘性的大小並不完全取決於其含量，也取決於分子量大小(Sanlinier等，1994)。另外，抽提條件對其粘度有明顯的影響。
（2）沉澱法：其原理是利用特定的鹽或有機溶劑沉澱抽提液中的β-葡聚糖(Wood，1986)。該方法的局限性在於抽提不能完全排除其它物質的干擾。在高溫下抽提時，抽提液中含有其它成分如澱粉等，因而干擾測定的結果。
（3）酶法：Anderson等(1978)採用特定的β-葡聚糖內切酶得到寡糖，經酸解後採用葡萄糖氧化酶/過氧化酶試劑測定葡萄糖的含量。此法後經Henry等(1988)修改為測定還原糖的含量，這樣雖然精確性和可靠性有所降低，但因測定更為迅速而實用性明顯提高。另外，Martin等(1981)和鄭祥建等(1995)用纖維素酶測定穀物中β-葡聚糖的含量。這主要根據纖維酶不能分解微晶纖維素，而穀物中的纖維素多為微晶狀，因而不至於干擾β-葡聚糖的測定結果。由於酶法不需要抽提，選用的酶為特定的，因而精確性和可靠性較高。
（4）熒光法：主要是利用熒光物質(Calcoflour)可與β-葡聚糖特異性結合，而與其它多糖如纖維素、戊聚糖的親和力很弱這一特性進行測定。Wood等(1984)利用此法測定了燕麥的β-葡聚糖含量。Sendry等(1989)則利用改進的Calcoflour-FIA法測定了啤酒和麥芽汁的β-葡聚糖含量。由於此法操作簡單，可進行大批量的樣品測定，因此有較好的實際應用價值
（5）剛果紅法：根據剛果紅與β-葡聚糖結合具有高度專一性，將剛果紅加入樣品溶液中，在一定溫度下准確反應一定時間後，測定其吸光度，根據β-葡聚糖標准曲線可知樣品中β-葡聚糖的含量。

4. 在波長552nm下制葡萄糖標准曲線，正確的吸光度是多少謝謝~

以濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，做一條45度且過原點的直線。在橫坐標標出每個試管的濃度及其縱坐標所對應的吸光度為點坐標（濃度x，吸光度值y）。看看八個點是否在直線上，一般只要有3-5個點在直線上就可以。

5. 鑒定多糖的方法

1、方法提要
食品中相對分子質量>1×104的高分子物質在80%乙醇溶液中沉澱，與水溶液中單糖和低聚糖分離，用鹼性二價銅試劑選擇性地從其他高分子物質中沉澱具有葡聚糖結構的多糖，用苯酚-硫酸反應以碳水化合物形式比色測定其含量，其顯色強度與粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此計算食品中粗多糖含量。

2、主要儀器
（1）分光光度計。
（2）離心機（3000r/min）。 （3）旋轉混勻器。

3、試劑
本方法所用試劑除特殊註明外，均為分析純；所用水為去離子水或同等純度蒸餾水。
（1）乙醇溶液（80%）：20mL水中加入無水乙醇80mL，混勻。
（2）氫氧化鈉溶液（100g/L）：稱取100g氫氧化鈉，加水溶解並稀釋至1L，加入固體無水硫酸鈉至飽和，備用。
（3）銅試劑儲備液：稱取3.0gCuSO4•5H2O，30.0g檸檬酸鈉，加水溶解並稀釋至1L，混勻，備用。
（4）銅試劑溶液：取銅試劑儲備液50mL，加水50mL，混勻後加入固體無水硫酸鈉12.5g並使其溶解。臨用新配。
（5）洗滌劑：取水50mL，加入10mL銅試劑溶液、10mL氫氧化鈉溶液，混勻。
（6）硫酸溶液（10%）：取100mL濃硫酸加入到800mL左右水中，混勻，冷卻後稀釋至1L。
（7）苯酚溶液（50g/L）：稱取精製苯酚5.0g，加水溶解並稀釋至100mL，混勻。溶液置冰箱中可保存1個月。
（8）葡聚糖標准儲備液：准確稱取相對分子質量5×105已乾燥至恆重的葡聚糖標准品0.5000g，加水溶解，並定容至50mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含10.0mg葡聚糖。
（9）葡聚糖標准使用液：吸取葡聚糖標准儲備液1.0mL，置於100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液1mL含葡聚糖0.10mg。

4、測定步驟
（1）樣品處理：
a、沉澱粗多糖：准確吸取液體樣品5.0mL，置於50mL離心管中，加入無水乙醇20mL，混勻5min後，以3000r/min離心5min，棄去上清液，反復操作3~4次。殘渣用水溶解並定容至5.0mL，混勻後，供沉澱葡聚糖。
b、沉澱葡聚糖：准確吸取b項終溶液2mL置於20mL離心管中，加入100g/L氫氧化鈉溶液2.0mL銅試劑溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷卻，以3000r/min離心5min，棄去上清液。殘渣用洗滌液數毫升洗滌，離心後棄去上清液，反復操作3次，殘渣用10%（體積分數）硫酸溶液2.0mL溶液並轉移至50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液為樣品測定液。
（2）標准曲線的繪制：准確吸取葡聚糖標准使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL（相當於葡聚糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg）分別置於25mL比色管中，准確補充水至2.0mL，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0mL，於旋轉混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻後用分光光度計在485nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。以葡聚糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標准曲線。
（3）樣品測定：准確吸取樣品測定液2.0mL置於25ml比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0mL於旋轉混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻至室溫，用分光光度計在485nm波長處，以試劑空白為參比，1cm比色皿測定吸光度值。從標准曲線上查出葡聚糖含量，計算樣品中粗多糖含量。同時做樣品空白實驗。

5、結果計算
(m1-m2)×V1×V3×V5 X= —————————— m3×V2×V4×V6式中 X—樣品中粗多糖含量（以葡聚糖計）（mg/g）；
m1—樣品測定液中葡聚糖的質量（mg）；
m2—樣品空白液中葡聚糖質量（mg）；
m3—樣品質量（g）；
V1 —樣品提取液總體積（mL）；
V2—沉澱粗多糖所用樣品提取液體積（mL）；
V3 —粗多糖溶液體積（mL）；
V4—沉澱葡聚糖所用粗多糖溶液體積（mL）；
V5—樣品測定液總體積（mL）；
V6—測定用樣品測定溶液體積（mL）。

6、准確度與精密度在不同食品中進行不同濃度的加標回收實驗，回收率為87.8%~110.87%，不同實驗室對同一樣品進行10次測定結果的相對標准偏差為5.8%。

6. 測定糖的含量的方法有哪些

糖的測定方法
一般有四種方法：
1、 直接滴定法。

原理為 糖還原天藍色的氫氧化銅為紅色的氧化亞銅。缺點：水樣中的還原性物質能對糖的測定造成影響。

2、 高錳酸鉀滴定法。

所用原理同直接滴定法。缺點：水樣中的還原性物質能對糖的測定造成影響，過程較為復雜，誤差大。

3、硫酸苯酚法。

糖在濃硫酸作用下，脫水形成的糠醛和羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10-100mg范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用於甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，並且產生的顏色穩定160min以上。

缺點：如果水樣呈橙紅色（大部分水樣為黃色），會對比色法造成較大的干擾。

4、蒽酮法

糖在濃硫酸作用下，可經脫水反應生成糠醛和羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用於糖的測定。

缺點：，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺。

綜合比較；採用蒽酮法能將最為准確地測定尾水中糖的含量。

（一） 直接滴定法

Ⅰ、原理

v 一定量的鹼性酒石酸銅甲、乙液等量混合，立即生成天藍色的氫氧化銅沉澱，這種沉澱很快與酒石酸鈉反應，生成深藍色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡合物。在加熱條件下，以次甲基藍作為指示劑，用標液滴定，樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應，生成紅色的氧化亞銅沉澱，待二價銅全部被還原後，稍過量的還原糖把次甲基藍還原，溶液由藍色變為無色，即為滴定終點。根據樣液消耗量可計算出還原糖含量。
樣品經除去蛋白質後，在加熱條件下，以次甲基藍做指示劑，滴定標定過的鹼性酒石酸銅溶液（用還原糖標准溶液標定鹼性酒石酸銅溶液），根據樣品溶液消耗體積計算還原糖量。

Ⅱ、儀器和試劑
1．儀器
酸式滴定管，可調電爐（帶石棉板），250ml容量瓶。
2．試劑

1. 鹽酸。

2. 鹼性酒石酸銅甲液：稱取15g硫酸銅（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基藍，溶於水中並稀釋至1000mL。

3. 鹼性酒石酸銅乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉與75g氫氧化鈉，溶於水中，再加入4g亞鐵氰化鉀，完全溶解後，用水稀釋至1000 ml，貯存於橡膠塞玻璃瓶內。

4. 乙酸鋅溶液：稱取21.9 g乙酸鋅，加3ml冰乙酸，加水溶解並稀釋至100ml。

5. 亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6g亞鐵氰化鉀，用水溶解並稀釋至100ml。

6. 葡萄糖標准溶液：准確稱取1.0000g經過96℃±2℃乾燥2h的純葡萄糖，加水溶解後加入5ml鹽酸，並以水稀釋至1000L。此溶液相當於1mg/ml葡萄糖（註：加鹽酸的目的是防腐，標准溶液也可用飽和苯甲酸溶液配製）。

7. 果糖標准溶液：按⑹操作，配製每毫升標准溶液相當於1mg的果糖。

8. 乳糖標准溶液：按⑹操作，配製每毫升標准溶液相當於1mg的乳糖。

9. 轉化糖標准溶液：准確稱取1.0526g純蔗糖，用100ml水溶解，置於具塞三角瓶中加5ml鹽酸（1+1），在68℃~70℃水浴中加熱15min，放置至室溫定容至1000ml，每ml標准溶液相當於1.0mg轉化糖。

Ⅲ、實驗步驟
1．樣品處理
⑴ 乳類、乳製品及含蛋白質的食品：稱取約2.50～5.00g固體樣品（吸取25～50ml液體樣品），置於250 ml容量瓶中，加50 ml水，搖勻。邊搖邊慢慢加入5ml乙酸鋅溶液及5ml亞鐵氫化鉀溶液，加水至刻度，混勻。靜置30 min，用乾燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。（注意：乙酸鋅可去除蛋白質、鞣質、樹脂等，使它們形成沉澱，經過濾除去。如果鈣離子過多時，易與葡萄糖、果糖生成絡合物，使滴定速度緩慢；從而結果偏低，可向樣品中加入草酸粉，與鈣結合，形成沉澱並過濾。）

⑵ 酒精性飲料：吸取100ml樣品，置於蒸發皿中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，在水浴上蒸發至原體積1/4後，移入250ml容量瓶中，加水至刻度。

⑶ 含多量澱粉的食品：稱取10.00～20.00g樣品，置於250ml容量瓶中，加200ml水，在45℃水浴中加熱1h，並時時振搖（注意：此步驟是使還原糖溶於水中，切忌溫度過高，因為澱粉在高溫條件下可糊化、水解，影響檢測結果。）。冷後加水至刻度，混勻，靜置，沉澱。吸取200ml上清液於另一250ml容量瓶中，慢慢加入5ml乙酸鋅溶液及5ml亞鐵氫化鉀溶液，加水至刻度，混勻，沉澱，靜置30 min，用乾燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。

⑷ 汽水等含有二氧化碳的飲料：吸取100ml樣品置於蒸發皿中，在水浴上除去二氧化碳後，移入250ml容量瓶中，並用水洗滌蒸發皿，洗液並入容量瓶中，再加水至刻度，混勻後備用。（注意：樣品中稀釋的還原糖最終濃度應接近於葡萄糖標准液的濃度。）

2. 標定鹼性酒石酸銅溶液：吸取5.0ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0ml乙液，置於150ml錐形瓶中（注意：甲液與乙液混合可生成氧化亞銅沉澱，應將甲液加入乙液，使開始生成的氧化亞銅沉澱重溶），加水10 ml，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加約9 ml葡萄糖標准溶液或其他還原糖標准溶液，直至溶液蘭色剛好褪去為終點，記錄消耗的葡萄糖標准溶液或其他還原糖標准溶液總體積，平行操作三份，取其平均值，計算每10 ml（甲、乙液各5 ml）鹼性酒石酸銅溶液相當於葡萄糖的質量或其他還原糖的質量（mg）。（注意：還原的次甲基藍易被空氣中的氧氧化，恢復成原來的藍色，所以滴定過程中必須保持溶液成沸騰狀態，並且避免滴定時間過長。）

3. 樣品溶液預測：吸取5.0 ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0 ml乙液，置於150 ml錐形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，控制在2 min內加熱至沸，趁沸以先快後慢的速度，從滴定管中滴加樣品溶液，並保持溶液沸騰狀態，待溶液顏色變淺時，以每兩秒1滴的速度滴定，直至溶液藍色褪去，出現亮黃色為終點。如果樣品液顏色較深，滴定終點則為蘭色褪去出現明亮顏色（如亮紅），記錄消耗樣液的總體積。（注意：如果滴定液的顏色變淺後復又變深，說明滴定過量，需重新滴定。） 當試樣溶液中還原糖濃度過高時應適當稀釋，再進行正式測定，使每次滴定消耗試樣溶液的體積控制在與標定鹼性酒石酸酮溶液時所消耗的還原糖標准溶液的體積相近，約在10ml左右。當濃度過低時則採取直接加入10ml樣品溶液，免去加水10ml，再用還原糖標准溶液滴定至終點，記錄消耗的體積與標定時消耗的還原糖標准溶液體積之差相當於10ml試樣溶液中所含還原糖的量。

4. 樣品溶液測定：吸取5.0 ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0 ml乙液，置於150 ml錐形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，在2 min內加熱至沸，快速從滴定管中滴加比預測體積少1 ml的樣品溶液，然後趁沸繼續以每兩秒1滴的速度滴定直至終點。記錄消耗樣液的總體積，同法平行操作兩至三份，得出平均消耗體積。

5. 計算
樣品中還原糖的含量（以某種還原糖計）按下式計算。
X=〔A/(m×V/250×1000)〕×100
式中：X--樣品中還原糖的含量(以某種還原糖計)，單位 g/100g；
A—鹼性酒石酸銅溶液（甲、乙液各半）相當於某種還原糖的質量，單位 mg；
m--樣品質量，單位 g；
V--測定時平均消耗樣品溶液的體積，單位 ml；
計算結果保留小數點後一位。

注意：

滴定結束，錐形瓶離開熱源後，由於空氣中氧的氧化，使溶液又重新變藍，此時不應再滴定。

（二）高錳酸鉀滴定法

v 原理 將樣液與一定量過量的鹼性酒石酸銅溶液反應，還原糖將二價銅還原為氧化亞銅，經過濾，得到氧化亞銅沉澱，加入過量的酸性硫酸鐵溶液將其氧化溶解，而三價鐵鹽被定量地還原為亞鐵鹽，用高錳酸鉀標准溶液滴定所生成的亞鐵鹽，根據高錳酸鉀溶液消耗量可計算出氧化亞銅的量，再從檢索表中查出氧化亞銅量相當的還原糖量，即可計算出樣品中還原糖含量。

（三）硫酸苯酚法

Ⅰ、原理

糖在濃硫酸作用下，脫水形成的糠醛和羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10-100mg范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用於甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，並且產生的顏色穩定160min以上。

多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，並迅速脫水生成糖醛衍生物，然後與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。

Ⅱ、試劑

1． 濃硫酸：分析純，95.5%

2． 80%苯酚：80克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光長期儲存。

3． 6%苯酚：臨用前以80%苯酚配製。（每次測定均需現配）

4． 標准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析純葡萄糖。

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中長期儲存。

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中長期儲存。

7． 6mol/L 氫氧化鈉：120克分析純氫氧化鈉溶於500ml水。

8． 6mol/L 鹽酸

Ⅲ、操作。

1．製作標准曲線：准確稱取標准葡聚糖（或葡萄糖）20mg於500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸餾水補至2.0ml，然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻，室溫放置20分鍾以後於490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標為多糖微克數，縱坐標為光密度值，得標准曲線。

2．樣品含量測定：

①取樣品1克（濕樣）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少許5％TCA溶液研磨，倒上清液於10毫升離心管中，再加少許5％TCA溶液研磨，倒上清液，重復3次。最後一次將殘渣一起到入離心管。注意：總的溶液不要超出10毫升。（既不要超出離心管的容量）。

②離心，轉速3000轉/分鍾，共三次。第一次15分鍾，取上清液。後兩次各5分鍾取上清液到25毫升錐形比色管中。最後濾液保持18毫升左右。（測肝胰腺樣品時，每次取上清液時應過濾。因為其脂肪含量大容易夾帶殘渣。）

③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 鹽酸之後搖勻，在96℃水浴鍋中水浴2小時。

④定容取樣。水浴後，用流水冷卻後加入2毫升6mol/L 氫氧化鈉搖勻。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的樣品液，以蒸餾補至2.0ml，然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置20分鍾以後於490nm測光密度。每次測定取雙樣對照。以標准曲線計算多糖含量。

Ⅳ、注意

（1）此法簡單、快速、靈敏、重復性好，對每種糖僅製作一條標准曲線，顏色持久。

（2）製作標准線宜用相應的標准多糖，如用葡萄糖，應以校正系數0.9校正μg數。

（3）對雜多糖，分析結果可根據各單糖的組成比及主要組分單糖的標准曲線的校正系數加以校正計算。

（4）測定時根據光密度值確定取樣的量。光密度值最好在0.1——0.3之間。比如：小於0.1之下可以考慮取樣品時取2克，仍取0.2ml樣品液，如大於0.3可以減半取0.1ml的樣品液測定。

（四）蒽酮法

Ⅰ、實驗原理

糖在濃硫酸作用下，可經脫水反應生成糠醛和羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用於糖的測定。

該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖和己糖，而且可以測所有的寡糖類和多糖類，其中包括澱粉、纖維素等（因反應液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發生反應。所以，用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺。故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。

Ⅱ、試劑：

蒽酮試劑，0.20 g蒽酮溶入100 mL 95%濃硫酸中，冰箱保存；

Ⅲ、方法：

樣品2.0 mL加5.0 mL蒽酮試劑，混勻，然後水浴煮沸10 min，取出冷卻至室溫，在620 nm處測定其吸光度，根據標准曲線計算水樣中糖的濃度。（標線以葡萄糖為標樣）